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      人們對外泌體的診斷和治療潛力越來越感興趣，但是對這些細胞外囊泡的確切描述仍然是未知的。針對這個問題，來自美國范德堡大學醫(yī)學中心的Robert J. Coffey課題組在近期的Cell雜志上發(fā)表文章，根據(jù)嚴格的分離方法對外泌體進行了重新評估，挑戰(zhàn)了這些細胞間通信載體的一些公認特性。

      細胞釋放不同大小、不同細胞內(nèi)起源的胞外小泡（EVs）。EVs的異質(zhì)性和非囊泡性細胞外納米顆粒的存在對我們理解不同分泌成分的組成和功能特性構成了主要障礙。更精確地了解RNA、DNA和蛋白質(zhì)所在的正確細胞外組分，并確定它們的分泌機制，對于識別生物標志物和設計未來的藥物干預至關重要。

     外泌體是由內(nèi)體衍生的40-150納米的小細胞外囊泡(sEVs)，由大多數(shù)細胞分泌。RNA（包括mRNA、microRNA [miRNA]和其他非編碼RNA）、DNA和脂質(zhì)被報道積極和選擇性地整合到腔內(nèi)小泡(ILVs)中，這些小泡位于多泡內(nèi)體(MVEs)中，是外泌體的前體。除了形成外泌體中膜蛋白的組分，內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽被認為會導致胞質(zhì)蛋白和其他成分被吞噬到ILVs的腔內(nèi)的機制。MVEs與質(zhì)膜融合后，將ILVs作為外泌體釋放到細胞外空間。相比之下，微泡是由質(zhì)膜脫落產(chǎn)生的150-1000 nm的大細胞外膜泡（lEVs）。然而，至今仍然缺乏區(qū)分微泡和外泌體的特異性標記物。

      最近人們對EVs的興趣越來越大，主要是由于發(fā)現(xiàn)外泌體在分泌的細胞外RNA (exRNA)的轉(zhuǎn)運中起作用，包括細胞外miRNA和mRNA轉(zhuǎn)運。Argonautes (Agos)是重要的miRNA加工蛋白，外泌體介導Ago蛋白分泌仍是一個懸而未決的問題。其他RNA結(jié)合蛋白(RBPs)也被報道存在于外泌體中，可能具有RNA分選的作用。然而，細胞外囊泡和納米顆粒的異質(zhì)性，以及純化策略的差異，使當前外泌體的分析變得混亂。

      來自范德堡大學的研究人員近期在Cell雜志上發(fā)表文章，對外泌體組成進行了重新評估，確定了蛋白質(zhì)、RNA和DNA在小細胞外囊泡和非囊泡細胞外物質(zhì)之間的差異分布，并確定小細胞外囊泡不是活躍的DNA釋放載體。

      傳統(tǒng)外泌體分離方法和該研究改善的外泌體分離方法的對比

     (A) 傳統(tǒng)的外泌體分離方法產(chǎn)生了富含外泌體且無大細胞外囊泡(lEVs)的囊泡和非囊泡的混合物。

     (B) 該報道改善的外泌體分離方法采用兩步法，首先使用高分辨率密度梯度離心從小細胞外囊泡(sEVs)中分離出非囊泡部分，然后通過直接免疫親和捕獲(DIC)從非外泌體sEVs中分離出真正的經(jīng)典外泌體。經(jīng)典外泌體由四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的表達標記，而非外泌體sEVs由annexins A1和A2標記。

      該研究采用高分辨率密度梯度分離技術將sEVs從非囊泡性顆粒中分離出來，并采用直接免疫親和捕獲技術（direct immunoaffinity capture, DIC）將外泌體從其他類型的sEVs中分離出來。DIC在無超離的情況下，以經(jīng)典的外泌體四次跨膜蛋白為靶點，采用捕獲珠進行分離。蛋白質(zhì)組學和核酸分析表明，細胞外RNA和蛋白質(zhì)在sEVs和非囊泡組分中有不同的表達。包括Ago1-4在內(nèi)的許多與外泌體裝載exRNA相關的RBPs與帶有外泌體標記蛋白CD63、CD81和CD9的經(jīng)典外泌體無關。外泌體缺乏細胞骨架元素和常見的糖酵解酶；這些高度豐富的胞質(zhì)蛋白的缺乏表明外泌體的裝載一定是一個高度調(diào)控的過程。這些研究是使用人類結(jié)腸癌(DKO-1)和膠質(zhì)母細胞瘤(Gli36)癌細胞系進行的。這一主要發(fā)現(xiàn)在正常人類腎上皮細胞和血漿中得到了證實。

DKO-1細胞分泌的大細胞外囊泡（lEV）、小細胞外囊泡（sEV）和非囊泡組分的電鏡圖

     人們一直認為外泌體是細胞外DNA分泌的載體，使它們成為癌癥患者液體活檢的誘人目標。該研究提供的證據(jù)表明，雙鏈DNA (dsDNA)和DNA結(jié)合組蛋白不存在于外泌體或任何其他類型的sEV中。相反，該研究證明細胞外dsDNA和組蛋白的活躍分泌是通過自噬和MVE依賴的機制發(fā)生的，而不依賴于外泌體。此外，該研究確定annexin A1是經(jīng)典質(zhì)膜形成的微泡的一個標志蛋白。這些發(fā)現(xiàn)更精確地闡明了外泌體成分，為探索其功能特性提供了更堅實的基礎。

      細胞外dsDNA和組蛋白的分泌不依賴于外泌體和小細胞外囊泡

      該研究表明，真正的外泌體在生物分子成分方面的范圍要比人們普遍接受的小得多。雖然外泌體的分類標準本質(zhì)上不是非常的精準的，但科學命名法的精確性對于確保實驗觀察之間的一致性至關重要。正確地將功能定位到適當?shù)募毎鈱嶓w將是其作為生物標志物或治療手段成功應用的必要條件。

參考文獻：

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Pluchino S, Smith JA. Explicating Exosomes: Reclassifying the Rising Stars of Intercellular Communication. Cell. 2019 Apr 4;177(2):225-227. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.020.