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1、分離方法適用于哪些種類樣品中的外泌體提取？

可用于細(xì)胞上清液、血清、血漿、尿液及其他低密度體液（如腦脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等）的外泌體提取。

2、樣品在提取外泌體之前是否可以低溫保存？

可以。血樣、尿樣、體液等，需要攢齊了一起提取，或者同一個患者的樣本多次提取。凍存前，首先要離心去除細(xì)胞和血小板，再將樣品分裝凍存于-20或-80℃。但如果有條件最好還是用新鮮樣品立即進(jìn)行提取。長期請保存于-80℃，無須加凍存液；短期（1-2天內(nèi)）則保存于4℃即可。

3、外泌體提取后是否可以凍存？

可以。使用硅化E.P.管或凍存管，減少exosome的粘附。Exosome能夠承受反復(fù)凍融，建議分裝，避免多次反復(fù)凍融。對于一些功能性實(shí)驗(yàn)，建議不要凍存，直接使用新鮮提取或保存在4℃懸浮于PBS 中的exosome。4℃保存不超過一周，-80℃條件下可長期保存。

4、需要從血漿中分離外泌體，可以使用肝素或EDTA管去收集血液樣本嗎？

不可以。肝素將會大大損害接下來的RNA實(shí)驗(yàn)。EDTA也許會干擾PCR 實(shí)驗(yàn)。使用無肝素?zé)oEDTA管去收集血液樣本。立即離心樣品收集血漿用于exosome分離。如果必須使用抗凝劑，用EDTA管收集血液。如果有必要的話在接下來的PCR反應(yīng)中調(diào)整Mg++的濃度。采血管的選擇：血漿（plasma）：紫蓋采血管；血清（serum）：黃蓋采血管（促凝管或促凝管帶分離膠）。

5、粘度過大的樣品如何處理？

如果樣品粘度過大時（因細(xì)胞分泌物較多所致），可將樣品用1×PBS緩沖液進(jìn)行等體積稀釋。

6、培養(yǎng)細(xì)胞時，如何去除血清來源的外泌體？

多數(shù)情況下，細(xì)胞在體外培時養(yǎng)需要血清，而血清中一般都含有外泌體，為避免血清對細(xì)胞外泌體的污染，可采用以下兩種方法：

（1）將細(xì)胞培養(yǎng)用的血清通過1×10⁵g超速離心10h以去除血清外泌體；

（2）選擇無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

7、無外泌體血清培養(yǎng)基（或者無血清培養(yǎng)基）在什么時候使用？

細(xì)胞在正常含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的時間后，細(xì)胞融合度約為60%-70%時，移去原有含血清的培養(yǎng)基，換成新鮮的無外泌體血清培養(yǎng)基（或者無血清培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，細(xì)胞融合度達(dá)到80%-95%左右時收取上清,該上清液即可用于提取外泌體。

8、細(xì)胞培養(yǎng)過程中的死細(xì)胞是否會影響外泌體的提??？

會的。在收獲細(xì)胞時，應(yīng)確定死亡細(xì)胞占比不超過5%。細(xì)胞凋亡/死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡，它們在外泌體的提取純化過程中會污染活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體。

9、如何鑒定提取的外泌體？

通常使用透射電鏡檢測（形態(tài)）、粒徑檢測（大小）、Western blot檢測等方法鑒定提取的外泌體。在進(jìn)行Western blot檢測時，通常檢測外泌體標(biāo)志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101等）。

10、準(zhǔn)備做細(xì)胞外泌體Small RNA的NGS測序，初始樣品量需要準(zhǔn)備多少？

普通腫瘤細(xì)胞系推薦使用40mL以上的初始樣品量。由于某些細(xì)胞（如懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等）中外泌體含量比較低，建議先通過10kD超濾柱濃縮，準(zhǔn)備40mL以上的濃縮液再進(jìn)行超速離心分離外泌體。

11、進(jìn)行外泌體RNA RT-PCR實(shí)驗(yàn)推薦什么內(nèi)參？

取決于具體樣品，可以選擇外源添加cel-miR-39-3p，或內(nèi)源U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72作為內(nèi)參。

12、提取的外泌體進(jìn)行Western blot前是否需要加入RIPA試劑裂解？

需要，一般按照1:1的比例加入RIPA試劑。

13、進(jìn)行外泌體Western blot鑒定時有無內(nèi)參蛋白可供選擇？

無，該檢測屬于定性檢測。      

14、組織細(xì)胞外泌體如何提??？

無菌環(huán)境下將組織剪成小塊（越小越好），然后在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4℃以3000g離心20 min去除培養(yǎng)液中雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；先使用0.45μm濾器過濾上清液，接著使用0.2μm濾器過濾上清液，再進(jìn)行超速離心分離外泌體。